Experiment (RNA extraction)

A       IDENTITAS

          Hari/Tanggal    : Senin / 9 Juli 2012

          Waktu               : 09.00-12.00

B       KEGIATAN                                 

          Experiment (RNA extraction)

C       RINGKASAN KEGIATAN

          Hari ini kami dibimbing untuk melakukan ekstraksi RNA dari kecambah tanaman dengan menggunakan TRIzol reagent. TRIzol reagent merupakan reagent yang umum digunakan untuk mengisolasi RNA dengan kualitas tinggi pada semua jenis sampel. Reagent ini mengandung phenol dan guanidine isothiocyanate. Selama praktikum kami dibimbing oleh tiga orang asisten Prof. Wenbio Shen. Mereka adalah Zeyu Cao, Weiti Cui, dan Qijiang Jin. Antara kelas biologi dan kimia dipisah. Kelas biologi dibagi menjadi beberapa kelompok, 1 kelompok terdiri dari 2 orang anggota.

          RNA merupakan salah satu bagian dari kelompok nukleat acid. RNA ada tiga macam yaitu mRNA, tRNA, dan rRNA. Sampel yang dipakai adalah kecambah dari suatu tanaman yang memiliki 2 daun. Setiap kelompok cukup mengambil 1 kecambah. Selain TRIzol reagent, bahan lain yang perlu dipersiapkan untuk praktikum antara lain:

•       Chloroform

•       Isopropyl alcohol

•       75% ethanol

•       RNase-free water

•       Centrifuge and rotor capable of reaching up to 12,000 g

•       PP micro-centrifuge tubes

•       Plastic glove

Langkah-langkah dalam melakukan ekstraksi atau isolasi RNA adalah sebagai berikut:

•       Add 1 mL TRIzol Reagent in a tube

•       Pre-cool mortar, pestle, and ladle using liquid N₂ for 3 times

•       Homogenize sample (80-100 mg) in liquid N₂ into powder

•       Transfer the powder into TRIzol Reagent rapidly

•       Cap the tube and shake vigorously for 15 s

•       Add 0.2 mL chloroform after 2-3 min

•       Cap the tube and shake vigorously for 15 s

•       Incubate for 2-3 min at room temperature

•       Centrifuge the sample at 12,000 g for 15 min

•       The mixture separates into a lower red phase, an interphase, and a colorless upper phase

•       Transfer the upper phase to a new tube. Avoid drawing any of the interphase or lower phase

•       Add 0.5 mL isopropyl alcohol

•       Cap the tube and shake tube vigorously for 15 s

•       Incubate in freezer for 5 min

•       Centrifuge the sample at 12,000 g for 15 min

•       RNA usually forms a gel-like pellet on the bottom of the tube. Sometimes it’s invisible

•       Remove the supernatant from the tube, and add 1 mL 75% ethanol

•       Vortex the sample briefly

•       Centrifuge the sample at 12,000 g for 5 min

•       Remove the ethanol from the tube

•       Short-spin the tube and remove the rest ethanol using pipette

•       Add 20 micro-L ddH₂O and vortex briefly

•       Electrophoresis

•       Mix 1 micro-L bromophenol blue and 5 micro-L sample on plastic glove, and add the mixture into the well

•       Normally, there are 3 bands in the electrophoretogram, which are 28s, 18s, and 5s RNA

•       The light intensity of 28s band is 2-fold higher than 18s band

•       The 5s band sometimes is invisible